در سال‌های اخیر توجه ویژه‌ای به غذاهای عملکردی یا (Functional Foods)، به‌ویژه محصولات کشاورزی در ژاپن و سایر کشورها شده است. این محصولات به دلیل دارا بودن ترکیبات زیست‌فعال مانند کاروتنوئیدها که نقش مهمی در سلامت انسان دارند مورد بررسی و استفاده قرار گرفته‌اند. یکی از این ترکیبات، β-کریپتوکسانتین است که عمدتاً در مرکباتی مانند پرتقال ماندارین، پاپایا و انبه یافت می‌شود. این تحقیق، به بررسی کمی β-کریپتوکسانتین در پرتقال ماندارین تازه با استفاده از دستگاه کروماتوگرافی یا همان (HPLC) از شیمادزو مطابق با استاندارد ژاپنی JAS 0003 می‌پردازد.
دستگاه LC-2050C شیمادزو
اهمیت β-کریپتوکسانتین در محصولات غذایی با روش LCMS-2050c شیمادزو
β-کریپتوکسانتین به دلیل دارا بودن خاصیت آنتی‌اکسیدانی قوی در حذف رادیکال‌های آزاد، پیشگیری از سرطان، نقش پیش‌ساز ویتامین A، کمک به سلامت بینایی و کاهش علائم پیری اهمیت بخصوصی دارد. طبق مقررات ثبت شده در ژاپن تحت عنوان Functional Food Claims (FFC) از سال ۲۰۱۵، محصولات دارای این ترکیب، می‌توانند به عنوان غذاهای عملکردی معرفی شوند.
شرایط تحلیلی β-کریپتوکسانتین توسط HPLC شیمادزو
تهیه نمونه و مواد شیمیایی با i-series LC-2050c شیمادزو
نمونه‌های پرتقال ماندارین تازه از بازار محلی تهیه و در دمای ۵ درجه سانتی‌گراد نگهداری شدند. تمامی مراحل تهیه نمونه در یک روز انجام شد تا از تغییر مقدار β-کریپتوکسانتین جلوگیری شود. استاندارد بالای β-کریپتوکسانتین، پیروگالول، آسکوربیل پالمیتات، هیدروکسید پتاسیم، سدیم کلرید و سدیم سولفات با درجه خلوص آزمایشگاهی و حلال‌هایی همچون، اتیل استات، پتروال اتر، اتانول، متانول، کلروفرم و ۲-پروپانول با درجه HPLC در آزمایش استفاده شدند.
شرایط آنالیز با دستگاه i-series LC-2050c شیمادزو
آنالیز با دستگاه Shimadzu i-series LC-2050C انجام شد. ستون استفاده شده Shim-pack GIS-HP C18 به ابعاد ۱۵۰×۳۰ میلی‌متر و اندازه ذره ۳ میکرومتر بود. فاز متحرک ترکیبی از متانول کلروفرم (۹۶ به ۴) همراه ۰/۱۲ میلی مولار آسکوربیل پالمیتات، سرعت فاز متحرک ۱ میلی لیتر بر دقیقه، دمای ستون ۴۰ درجه سانتی‌گراد و حجم تزریق ۱۰ میکرولیتر تعیین گردید. آشکارسازی در طول موج ۴۵۵ نانومتر انجام شد.
مراحل آماده‌سازی نمونه با دستگاه i-series LC-2050c شیمادزو
به منظور جداسازی و تعیین مقدار کاروتنوئیدها در نمونه‌های گیاهی، آماده‌سازی دقیق و استخراج مؤثر این ترکیبات پیش از آنالیز اهمیت ویژه‌ای دارد؛ نمونه‌ها بر اساس یک روش استاندارد شامل هموژنیزه‌کردن، صابون‌سازی و استخراج فاز آلی، برای تزریق به دستگاه HPLC آماده شدند که در زیر توضیح داده شده است.
- هموژنیزه کردن: نمونه پوست‌کنده خرد شده به مدت ۱۰ ثانیه در ۵۰۰۰ دور در دقیقه پودر شد. حدود ۲ گرم از نمونه برداشته و با ۱۵ میلی‌لیتر محلول اتانولی پیروگالول و ۱۰ گرم سدیم سولفات مخلوط گردید.
- صابون‌سازی (Saponification): افزودن ۱ میلی‌لیتر محلول KOH 60% و نگهداری در حمام آب ۷۰ درجه سانتی‌گراد به مدت ۳۰ دقیقه، سپس تا دمای محیط خنک‌سازی شد.
- استخراج: افزودن ۲۰ میلی‌لیتر NaCl، ۵ میلی‌لیتر ۲-پروپانول و ۱۲ میلی‌لیتر مخلوط هگزان-اتیل استات (۹:۱) و اختلاط به مدت ۵ دقیقه انجام شد.
- سانتریفیوژ: سانتریفیوژ با دور ۱۵۰۰ به مدت ۵ دقیقه، انتقال محلول فوقانی به بالن، تبخیر حلال تا خشکی در دمای ۴۰ تبخیر شد.
- مرحله نهایی: قبل از تزریق به دستگاه HPLC محلول مجددا در ۱۰ میلی‌لیتر اتانول حل و صاف‌سازی با فیلتر ۰/۲۲ میکرون صورت گردید.
رسم منحنی کالیبراسیون با دستگاه i-series LC-2050c شیمادزو
برای تعیین دقیق، منحنی کالیبراسیون با چهار سطح غلظتی (۰/۲۵، ۰/۵، ۱ و ۲ میکروگرم بر میلی‌لیتر) تهیه شد. استاندارد ما در ۱۰ میکروگرم در میلی‌لیتر در اتانول تهیه شده و مقدار دقیق آن با دستگاه اسپکتروفتومتر UV-VIS مدل 1900i شیمادزو تعیین شد تا صحت مقدار غلظت تضمین گردد. مقادیر به دست آمده برای سطوح کالیبراسیون ۰/۲۴۷ تا ۱/۹۸ میکروگرم بر میلی‌لیتر بود. ضریب همبستگی خطی ۰/۹۹۹ بالاتر از مقدار مورد نیاز (۰/۹۹۵) طبق JAS 0003 است.
کروماتوگرام استاندارد BCR حاصل از HPLC شیمادزو
محاسبه مقدار β-کریپتوکسانتین در پرتقال با دستگاه i-series LC-2050c شیمادزو
در آن C غلظت BCR در نمونه (μg/mL)، V حجم ارلن اندازه‌گیری (۵ میلی‌لیتر)، d1 حجم ثابت در استخراج (۵۰ میلی‌لیتر)، M وزن نمونه آزمایش (گرم)، d2 حجم حاصل از صابون‌سازی (۱۰ میلی‌لیتر) است. میانگین مقدار به‌دست آمده برای β-کریپتوکسانتین در نمونه‌های پرتقال حدود ۱۲/۳ میلی‌گرم بر کیلوگرم بوده است که با مقادیر مرجع (Annex A) تطابق داشت.
معادله اندازه گیری بتا کریپتوکسانتینل با دستگاه 2050c شیمادزو
W = مقدار BCR در نمونه‌های پرتقالی (میلی‌گرم بر کیلوگرم)
C = غلظت BCR در نمونه‌ها (میکروگرم بر میلی‌لیتر)
V = حجم ارلن مورد استفاده (5 میلی لیتر)
M = وزن نمونه‌های آزمایش (گرم)
d1 = حجم ثابت در زمان استخراج (50 میلی لیتر)
d2 = حجم کسر صابون‌سازی (10 میلی‌لیتر)
شناسایی و صحت روش بادستگاه i-series LC-2050c شیمادزو
شناسایی قله BCR با مقایسه زمان بازداری نمونه و استاندارد انجام گرفت که تطابق زمانی کمتر از ۰/۱ دقیقه و بدون وجود نویز آزاردهنده بود. میزان تکرارپذیری و قابلیت بازتولید طبق روش آزمایش بین آزمایشگاهی (Annex A) سنجیده شد. نتایج با آزمایشگاه معتبر مقایسه گردید که صحت داده‌ها را تأیید کرد.
پروفایل‌های کروماتوگرام از عصاره‌های Mandarin BCR، S1 (بالا) و S2 (پایین) در HPLC شیمادزو
کروماتوگرافی مایع با فشار بالا کمپانی شیمادزو یک روش سریع، دقیق و تکرارپذیر برای اندازه‌گیری β-کریپتوکسانتین در پرتقال ماندارین است که به راحتی می‌تواند در آزمایشگاه‌های کنترل کیفیت مواد غذایی یا پژوهش‌های غذاهای عملکردی به کار رود. پارامترهای مؤثر در آزمایش شامل دقت آماده‌سازی نمونه، کیفیت مواد مصرفی و کالیبراسیون دقیق بودند. این روش می‌تواند به عنوان یک ابزار کارآمد جهت ارزشیابی و برچسب‌گذاری عملکردی محصولات کشاورزی در صنعت غذا و سلامت مد نظر قرار گیرد.
در صورتی که قصد خرید دستگاه HPLC داشته باشید، می توانید از راهنمایی مشاوران با تجربه شرکت ری نور آزما استفاده کنید. شرکت ری نور آزما نماینده فروش طیف گسترده ای از تجهیزات آنالیتیکال و عمومی آزمایشگاهی در ایران می باشد.
